人們采取無(wú)菌操作的方法，把某種食用菌從混雜的微生物中，單獨(dú)地分離開(kāi)來(lái)，這個(gè)過(guò)程叫做菌種分離。從分離過(guò)程中得到的菌絲體純化后，就是純菌種。在實(shí)驗(yàn)室條件下，以人工使純菌種大量生長(zhǎng)和繁殖的方法，叫做培養(yǎng)。下面由小編帶大家了解一下，如何培養(yǎng)菌種。

1.1材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH為7，（可溶性淀粉20g）瓊脂20g。

（2）篩選用培養(yǎng)基：含有2%可溶性淀粉的LB培養(yǎng)基。 

（3）種子培養(yǎng)基：豆餅粉4%，玉米粉3%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，H2O。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉5.6%，玉米粉7.2%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%， NH4Cl0.13%，CaCl20.13%，α—淀粉酶50g。

【2】 1.1.3 主要試劑

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麥芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、(Beef Extract）、尿素、氯化銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉和氯化鈣。

1.1.4 儀器設(shè)備

控溫?fù)u床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測(cè)定儀、無(wú)菌操作臺(tái)和紫外分光光度計(jì)。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

(1)稱(chēng)量

按培養(yǎng)基配比依次準(zhǔn)確地稱(chēng)取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入燒杯中，并在燒杯中加入少量蒸餾水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放在稱(chēng)量紙上，稱(chēng)量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，酵母膏便會(huì)與稱(chēng)量紙分離，然后立即取出紙片。

(2)溶化

可溶性淀粉溶液的配制方法：將所需克數(shù)的可溶性淀粉放入一個(gè)小燒杯中，加入少量蒸餾水，攪拌成糊狀，然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養(yǎng)基總體積的沸水中，一邊攪拌一邊加熱，待其溶化成透明狀后繼續(xù)在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液。 如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將已準(zhǔn)備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中，將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，補(bǔ)水到所需的總體積。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時(shí)，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然后按2%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同步進(jìn)行，節(jié)省時(shí)間。 在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時(shí)，不能用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。  

(3)調(diào)pH 培養(yǎng)基配好以后，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直到pH達(dá)7為止；反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。 對(duì)于有些要求pH較精細(xì)的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。 注意：pH不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度，配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固，因此應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開(kāi)滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整pH。

(4)分裝 按照實(shí)驗(yàn)要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶中。 液體分裝：分裝的高度以試管高度的1/4左右為宜；分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶的一半為宜。 固體分裝：分裝于試管中的應(yīng)不超過(guò)試管的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過(guò)一半為宜。

(5)加塞 培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

(6)包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，外邊再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)，組別，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣注明。

(7)滅菌 將配置好且包扎完畢的固體、液體培養(yǎng)基及本實(shí)驗(yàn)涉及的試管、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa，121℃條件下高壓蒸汽滅菌20分鐘。

(8)斜面擱置 將培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)放置斜面，斜面在試管的1/2處為宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。

1.2.2菌種的篩選與保藏

(1)倒平板 將實(shí)驗(yàn)配制好的培養(yǎng)基加熱溶化，待冷卻至55—60℃時(shí)，倒平板9皿。

(2)稀釋 用接種環(huán)取菌種，放入盛90ml無(wú)菌水的三角瓶中，振搖。用一支1ml無(wú)菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類(lèi)推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的菌液。

(3)劃線  將平板底面分別用記號(hào)筆寫(xiě)上10-4、10-5、10-6三種稀釋度（共三組）然后用接種環(huán)分別沾取濃度為10-4、10-5、10-6稀釋液并對(duì)號(hào)在相應(yīng)平板上劃線，室溫下靜止5—10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基。

(4)培養(yǎng) 將培養(yǎng)基平板倒置于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2—3天，觀察淀粉圈。對(duì)有淀粉圈的菌落，測(cè)量淀粉圈的直徑D，菌落直徑r，計(jì)算D/r的比值，可進(jìn)行拍照，選擇淀粉圈較大的菌落作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種。

(5)接種 接種到斜面培養(yǎng)基中，標(biāo)注上日期等信息。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為一級(jí)種子。

(6)保藏 斜面置于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2—3天，觀察菌種長(zhǎng)勢(shì)好壞，若菌種長(zhǎng)勢(shì)好則將其放入冰箱中保藏，若長(zhǎng)勢(shì)不好則需多次斜面轉(zhuǎn)接。

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